知组识谱 | 浅谈代谢组学研究的样本收集
2023-02-10 12:58:35
作为研究生物样品内所有小分子代谢产物变化的一个系统生物学研究的手段,代谢组学正受到越来越广泛的重视。和基因组学、转录组学和蛋白质组学研究的样品收集一样,代谢组学研究样本的收集也要考虑到收集过程中各种可能影响结果准确性的因素,以求最大限度地减小样品收集过程中引入的系统和人为误差对真实结果的影响。本文将会围绕代谢组学常见样品类型的收集提出一些原则性建议,代谢组学样品收集的具体标准流程可以参考凯莱谱的代谢组学样本收集手册。
01 代谢组学样本采样一致性
绝大多数可以收集的生物样本都适用于代谢组学研究。常见的样本主要有:血清、血浆、尿液、粪便、各类组织、其他体液、细胞(真核或原核)及其培养液等。在收集这些生物样本的过程中,因为代谢是一个非常动态的过程,每时每刻都可能在发生着变化,因此样本采集的一个重要原则就是一个项目中的所有样品在收集过程中的程序要尽量一致,避免因采集程序的不均一性在样品收集过程中引发系统误差。这要从两个方面来考虑,一是采集时尽快地停止样品中的代谢以免发生进一步的改变,即所谓的淬灭;二是将淬灭的样品尽快转入-80℃低温冰箱。尽管有不少文章讨论过各种样品的不同淬灭办法,但是我们建议的是用最简单实用和有效的方法,即收取样品后迅速在液氮中闪冻然后转入-80℃低温冰箱。没有液氮条件的就尽快将收集的样品转入-80℃冰箱低温储存。
当然很多医疗系统的研究者在样本收集过程中可能无法像在科研实验室环境下那样有条件迅速地把样品转入-80℃冰箱。对于这种实际情况我们的建议是,在收取样品后尽量缩短其暴露在其它温度的时间,越短越好,尽快地转运至-80℃冰箱保存。如果同一个代谢组学项目的样品要分多次现场采集后再转移到-80℃冰箱,则要注意每次采集时的样品采集程序保持一致(比如保持从样品收集到转入-80℃冰箱中间相隔的时间一致)。比如在A中心上午采集的样品只能在室温先放一个小时,然后转入4℃冰箱,下午运输到中心实验室转入-80℃冰箱,从采样到转入-80℃冰箱的时间为6小时;B中心的样品大概也是先要在室温放一个小时,然后放入冰盒里,下午运输到中心实验室存入-80℃冰箱,从采样到转入-80℃冰箱的时间大概是8个小时;这样可以认为是采样程序大概一致。而如果A中心的样品当天运到中心实验室放入-80℃冰箱立刻保存,而B中心的实验室样品要在室温或4℃放一夜然后第二天才运到中心实验室转入-80℃冰箱,这种情况下两个中心样本的一致性就会有很大的问题。
在上面提到的这些主要原则之下,我们再谈谈一些具体的样品类型在收集过程中可能碰到的实际问题。
02 体液样本
血液样本作为最常见的代谢组学样品之一,一个经常被问到的问题就是究竟是用血浆还是血清做代谢组学研究比较好。血浆和血清都是医院常见的血液样品采集类型,对于一个成熟稳定的代谢组学平台来说,两者间在可鉴定到的代谢物数目上基本没有差别,不同的只是同一代谢物在血浆和血清样品中的浓度可能不同。因此在一个代谢组学项目里所有样品都是同一种基质(血清或血浆)的情况下,使用血浆或血清开展实验不会有显著的差别。如果选择使用血浆,另一个需要考虑的是关于抗凝剂的选择问题。常用的抗凝剂有柠檬酸、EDTA、肝素等。柠檬酸是内源性代谢物,是重要代谢通路三羧酸循环的中间产物;而肝素作为生物内源性的抗凝剂也可能会影响一些特定代谢物的检测;所以,使用柠檬酸钠或肝素都存在干扰影响内源代谢物检测结果准确性的风险。因此我们建议避免使用柠檬酸和肝素作为抗凝剂,而应该首选EDTA作为血浆抗凝剂(比如EDTA-钠)。
另一种常见的体液代谢组学样品是尿液。尿液样品收集时一个需要注意的问题是避免细菌的污染生长。有些其他检测分析使用的尿液样品收集时,可能会在尿液中添加抑菌剂(比如叠氮化钠等),但对于抑菌剂对尿液代谢物在非靶向代谢组学检测过程中可能存在的的干扰,仍缺乏系统的研究评估,其对检测结果的影响不可控。因此非靶向代谢组学尿液样本在收集时应该避免使用抑菌剂,而代之液氮淬灭和尽快地将尿液样品转入-80°C冰箱保存。
03 固体样本
细胞样品的收集分为真核的动物培养细胞和原核细菌样品。对于附着培养的真核细胞,使用胰蛋白酶消化或刮取方法都可以考虑(记住所有样品采用一致的收取方法的原则)。温和的胰蛋白酶消化相比于刮取的方法更易于控制减少细胞的裂解,是比较常用的真核细胞收集方法。收取的细胞悬液应进行细胞计数以实现每个细胞样品中的起始细胞数一致。鉴于细胞计数可能存在的误差,对收集的细胞沉淀进行蛋白质浓度测定可以从另一个维度评估细胞计数的准确性。收集的细胞沉淀应尽可能除净培养基。有些研究会同时研究胞内(沉淀)和胞外(培养基里)的代谢物。这种情况下细胞沉淀和培养基都要收取。对于暂时不进行胞外代谢物分析的样品,也可以考虑先把培养基收集起来,这样以后需要研究胞外代谢物时可以有现成的与细胞沉淀样品匹配的同一批胞外样品。
组织样品收集时要注意取样部位的一致性,先用生理盐水冲去组织表面的血污,然后用吸水纸快速沾干。条件允许的话可以将组织切割成大小相似的组织块转入保存管,在液氮中速冻后尽快转入-80℃冰箱。植物组织样品的收集一般建议在液氮中研磨成粉,然后冷冻干燥,记录重量保存在-80℃冰箱待用。
随着肠道菌群与疾病的关联性研究逐渐成为近年来研究的热点,对粪便样品进行微生物组加代谢组学联合分析得到越来越普遍的应用,目前也有很多篇文献比较了不同的粪便样品收集方法对样品结果重复性的影响 [1]。粪便样品收集的传统标准方法是收集后迅速冷冻在-80℃冰箱保存,也是我们在日常的粪便样品代谢组学项目一直使用收集后-80℃速冻的传统样品收集方法,得到的结果的稳定性和可重复性都没有大的问题。大规模队列研究的粪便样品会面临医院外采集无法满足迅速转入-80℃冰箱的实际问题,针对这个问题,国外也有商业途径可购买的粪便采集装置,据称可确保粪便样品在室温下的代谢物稳定性达一周之久 [2]。
以上就是代谢组学常见的样本收集过程中的一些常见问题,对于其他特殊类型样品收集,在没有明确的收集方法时可以先根据样品采集原则制定一个初步方案收集几例样品做一下预实验,根据相关结果进行评估。
04 样本冻存的影响
和用于其他实验的样品一样,代谢组学样品也应该尽量避免反复冻融。Goodman et al. 等 [3]在2021年研究了EDTA抗凝血浆样品在融化后放置冰上的时间和反复冻融对代谢组学检测结果的影响。在冰上融化时间对代谢组学结果影响的实验中,从-80℃冰箱拿出的同样的血浆样品在冰上融化后的0、2、4、6小时后进行相同的代谢组学分析并对结果进行比较,结果发现在鉴定到的1026个代谢物中,冰上融化即检测(0小时)和6小时后再检测的检测结果差异小于1%。反复冻融的实验结果表明,冻融四次以后的血浆和第一次冻融的血浆样品的检测结果相比,有大约2%的代谢物的结果发生了变化(第四次冻融后检测的血浆和第一次冻融后检测的血浆相比有19个代谢物的变化超过15%)。因此虽然多达四次的反复冻融对代谢组学结果造成的影响并不如想象中的那么糟糕(至少对EDTA抗凝血浆样品如此),但还是要尽量避免反复冻融的发生,及早把样品进行适当体积的分装。
05 小结
总之,收集一个代谢组学项目的样品时,首先应该根据项目设计确定的样品类型了解相关的收集方法和注意点(可以从凯莱谱代谢组学平台获得相关资料)。制定样品收集方法时根据以下几个原则进行:一是尽快把收集的样品转入-80℃条件下保存。二是要尽量保证每个项目所有的样品收集时经历一致的收集过程,减少因为收集过程不同引入的误差。三是对样品的处理越简单越好,避免引入其它不可控因素或物质(比如尿液收集避免加入抑菌剂)等等。最好还要注意样品采集过程中环境的整洁,尽量避免非必要因素对样品的污染。其他需要注意的琐碎事项还包括比如每个样品管的标记要清晰可辨,要有唯一性标记,在-80℃环境下不会发生标签脱落或者标记消融,以及冻存管质量可靠、不会发生盖子脱落和管壁炸裂问题等等。
样品收集的好坏可以从源头影响一个代谢组学研究的最终结果,因此再怎么强调从源头保证收集的样品可以准确反映被研究对象在样品收集时的真实代谢状况的重要性都是不为过的。