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03-112022

重磅新品 | FFPE组织标本蛋白质组学分析助力乳腺癌精准分型

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*FFPE=Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (福尔马林固定石蜡包埋)




乳腺癌是全球女性高发的一种恶性肿瘤，近年来发病率有明显升高趋势[1]。根据世界卫生组织国际癌症研究机构IARC发布的世界癌症报告显示，从2020年开始，乳腺癌的新增发病率已取代肺癌成为全球第一大癌[2]。在我国，根据2019年国家癌症中心发布的统计数据，全国女性乳腺癌新发病例占女性恶性肿瘤发病的17.10%，位居女性恶性肿瘤发病第一位，每年发病约30.4万，目前的新增发病率高于全球平均水平。

乳腺癌是一种高度异质性的疾病，即使临床分期和病理分级相同，患者对治疗的反应和预后也是不同的。面对恶性肿瘤的异质性特征，尤其是目前暂无明确治疗靶点的三阴性乳腺癌，临床上亟需更加精准有效的诊断分型及治疗标准，以实现对疾病的精准治疗。


近日，加拿大不列颠哥伦比亚大学研究人员在国际期刊《自然通讯》杂志上发表题为“Proteomic analysis of archival breast cancer clinical specimens identifies biological subtypes with distinct survival outcomes（乳腺癌归档临床标本的蛋白质组学分析可识别生存结果差异明显的生物学亚型）”的研究论文[3]，文章对300例乳腺癌确诊患者的FFPE组织标本进行TMT定量蛋白质组学分析，发现在侵袭性PAM50分型的基底样(basal-like)病例中，存在两种生存期差异明显的亚型并确认为免疫应答相关蛋白的表达差异，对88例三阴性乳腺癌病例的分析也证实了这种差异的存在，从中发现了一系列潜在的生物标志物和治疗靶点，为临床上乳腺癌的精准分型与治疗提供依据。
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下面小编给大家分享一下这篇论文的研究内容。

01

实验设计

乳腺癌的基因组分类器（如基于RNA的PAM50）在临床上正逐渐成为分子亚型分类的金标准，但其仍有许多局限性，并未能完全解释肿瘤的异质性，而且目前临床上诊断和治疗决策往往参考的是蛋白质水平的信息，比如另一广泛应用的免疫组化IHC分型就是基于几个蛋白标志物的半定量检测，因此，通过蛋白质表达谱差异揭示乳腺癌异质性的蛋白质组分类器也逐渐被寄予厚望。

在本文中，作者选取了2008-2013年（n=178）和1986-1992年（n=122）两组乳腺癌诊断患者队列共300个FFPE手术标本，每一个病例都有完整的临床随访信息以及免疫组化IHC分型和PAM50分子分型信息，并且样本中PAM50的四个分型（Basal-like、Her2-enriched、LumA、LumB）各有75例。采用优化的FFPE标本痕量蛋白质组处理SP3-CTP工作流程和TMT多肽定量标记技术，实验设计了由38例健康女性的缩胸手术标本组成的正常对照组、由13种肿瘤细胞系混合蛋白组成的标准组、以及加入合成多肽内标的FFPE混合内标组。其中在混合内标组中，作者加入了706条合成多肽组成isoDoping文库，分别来自179个报道的乳腺癌低丰度重要蛋白，这些内标肽既能作为质谱信号归一化的标准，也能确保这些低丰度目标蛋白在所有样品中的定量检测。多肽标记后经高pH反相色谱预分级，然后在高分辨液质联用质谱仪上进行TMT定量蛋白质组学分析（样本分组信息及实验流程方案设计见图1、图2）。
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图1. 乳腺癌FFPE标本临床队列分组信息


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图2. SP3-CTP实验流程及标记方案设计


02

实验结果

作者在两个队列所有样本中共同定量到了4214种蛋白质（总定量蛋白数目为9088个），皮尔森相关分析结果显示定量重现性一致，定量结果可靠（见图3）。

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图3. FFPE标本08-13队列蛋白定量结果的生物学重复(a)与技术重复(b)皮尔森相关性分析


08-13队列样本中含有四种PAM50的基因组亚型，通过对1054个高度变化的蛋白质进行无监督一致性聚类分析，得到四种蛋白质组聚类结果（以下称蛋白质组亚型），作者发现，PAM50分类的basal-like亚型，能进一步细分为两种蛋白质组亚型（2号亚型和3号亚型），Kaplan-Meier生存曲线和Forest多变量生存分析结果显示，这两种蛋白亚型在无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）上都有着明显的差异，其中3号亚型是四种蛋白亚型中预后结果最好的而2号亚型则是最差的（见图4），另外PAM50分类的Her2-enriched亚型在四种蛋白质组亚型中均有分布，这进一步佐证了肿瘤的异质性。
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图4. 08-13队列的蛋白质组分型与PAM50基因组分型的对照关系（a）,以及4种蛋白质聚类亚型的生存结果分析（b、c）

作者接着对08-13队列蛋白质组3号亚型的差异蛋白进行功能分析，发现很多蛋白来自免疫应答相关通路和γ干扰素信号通路，如MHC-I抗原呈递相关蛋白、免疫蛋白酶体、MHC-II等等，GSEA基因富集分析的结果也表明其在免疫应答过程中的显著性富集。而在蛋白质组2号亚型的差异蛋白功能分析中，发现其主要在细胞间质和胞外基质富集，与DNA复制和修复等功能相关，在免疫应答相关的通路上则是低表达。在临床病理特征上，2号和3号亚型的免疫组化IHC测试结果大多为ER-/PR-/Her2-，伴随较高的增值指数Ki-67，EGFR+或CK5+,治疗上采用化学疗法而非激素疗法，2号亚型有较高的复发率，且展现出basal-like亚型的侵袭性特征如病灶会转移至大脑和肺部。在3号亚型中则发现存在肿瘤浸润淋巴细胞CD8+ TILs的高表达，揭示了肿瘤微环境的差异。
随后，作者选取了四个代表性的差异蛋白抗体进行生物学验证，发现在无复发生存期RFS良好的标本中，抗原呈递蛋白TAP1和HLA-DQA1存在高表达，而生存期差的标本中则为低表达。在其他176例乳腺癌病例中又进行了独立验证，也证实了这一发现，由于PAM50基底样亚型在临床上往往诊断为三阴性乳腺癌TNBC，因此实验揭示了这两个蛋白为潜在的治疗靶点。
为了进一步验证，作者对临床免疫组化IHC诊断为三阴性乳腺癌的88个病例进行了独立蛋白质组的聚类分析，在四个TNBC蛋白亚型中，1号亚型的生存结果明显优于其他亚型，而4号亚型则是最差的，具体分型信息及蛋白质功能分析结果见图5。1号亚型中肿瘤浸润淋巴细胞CD8+ TILs以及免疫应答蛋白TAP、HLA-DQA1均呈高表达，而4号亚型则很少发现免疫相关蛋白，这种差异揭示了对于临床上棘手的三阴性乳腺癌患者，通过蛋白质组的精准分型，可针对性的开发药物靶标实现更加有效的免疫疗法，为此实验筛选出85个候选蛋白标记物，从中有望取得突破性进展。
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图5. 三阴性乳腺癌病例的蛋白质组亚型分类及功能蛋白分析

此外，86-92队列标本尽管年代更久远，但其蛋白定量结果依然很丰富，蛋白质组聚类分型结果也与08-13队列吻合，而且发现对于接受它莫西芬抗雌激素治疗无复发生存期大于十年的Lumianl亚型患者，由此筛选到了一个候选的生物标志物——脂肪酸结合蛋白FABP7。



03

后记

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）是目前临床上长期保存病理样本的标准化方法，用于长期稳定保存临床患者样本组织的组织学和形态学结构，以便对疾病进行组织病理学诊断。由于其制备和保存的规范性，样品一致性较高，并且跟新鲜临床样本相比，FFPE一般关联了详尽的疾病诊断、治疗、预后等追踪溯源临床信息，有很高的临床科研价值。

FFPE蛋白质组学分析可为临床提供更多维度的信息，发现潜在的生物标记物和治疗靶点，帮助实现疾病的精准诊断和精准治疗。


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参考文献：

1. Harbeck N, Penault-Llorca F, Cortes J, et al. Breast cancer. Nature reviews Disease primers 2019;5(1):1-31

2. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a cancer journal for clinicians 2021;71(3):209-49

3. Asleh K, Negri GL, Spencer Miko SE, et al. Proteomic analysis of archival breast cancer clinical specimens identifies biological subtypes with distinct survival outcomes. Nature Communications 2022;13(1):1-19 


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