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02-142020

干货 | 植物代谢组学案例分享

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 在植物的抗逆境研究中,抗干旱的研究是一个重要的方向。除了研究跟抗旱相关的基因和蛋白方面,如何从植物内部代谢的角度来研究抗旱的机制也是一个很有趣且研究相对较少的领域。

       2011年在 Plant Cell 杂志上发表的一篇由美国农业部 MelvinJ. Oliver 博士和原 Metabolon 公司的 Lining Guo 博士主导的一项抗旱研究运用代谢组学手段对草本植物的抗旱机制进行了深入的探讨Oliver, M. J., et al. A sister group contrast using untargetedglobal metabolomic analysis delineates the biochemical regulation underlyingdesiccation tolerance in Sporobolus stapfianus. Plant Cell, 2011. 23(4):1231-48)。

       他们使用的两个抗旱表型截然相反的草本植物是Sporobolus stapfianus Sporobolus pyramidalis,同属鼠尾粟属的两个不同品种。两者虽然是同一个属的植物,却对干旱有着显著不同的反应。其中 S. pyramidalis 对干旱敏感,而 S. stapfianus 则有很强的抗干旱能力。对干旱敏感的 S. pyramidalis 在开始干旱后,当相对含水量(relative water content, RWC)小于60%以后就开始死亡。与此相反,抗干旱的 S. stapfianus 在开始干旱后,RWC低至5%依然能存活。



那么是什么原因导致了这两种非常相近的草本植物在抗旱表现上存在这么大的差异呢?


       研究者们运用代谢组学技术手段对这两种植物的叶片样本进行了研究。实验设计见图一,首先比较 S. stapfianus 和 S. pyramidalis 在干旱发生之前(Hydration)的叶片代谢组的差异,然后比较它们在干旱开始后 RWC=60% 时的代谢组差异,最后比较抗旱的 S. stapfianus 在非干旱(RWC=100%)和在各个干旱发展阶段(RWC=50%, 40%,20%)直到几乎完全干旱(RWC=5%)的代谢组变化( S. pyramidalis 未进行此比对因为在 RWC<60% 后 S. pyramidalis 即开始死亡)。                   

(图一)


(图二)
       代谢组学研究表明,在正常的未失水的环境下(干旱之前),两种植物的叶片代谢组就已经存在着较大的差异(图二)。有36 个代谢物在 S. stapfianus 浓度更高,而在 S. pyramidalis 中有34个代谢物浓度比在 S. stapfianus 中显著地高。这些在两者之间显著不同的代谢物明显地属于两大类:氨基酸代谢和能量代谢。在抗旱的 S. stapfianus叶片中,检测到的氨基酸中绝大部分都比在 S. pyramidalis 中浓度更高(3到451倍),包括 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Ser, Thr, and Val。其中天冬酰胺(Asn)的量在二者之间差别最大,比在 S. pyramidalis中高了451倍。在很多植物中,天冬酰胺(Asn)尿囊素(allantoin 还有甘氨酸(Gln是氮储存和运输的主要代谢物形式(allantoin 和 Gln 在 S. stapfianus 中比在 S. pyramidalis 中分别高出8倍和6倍)。氨基酸在植物细胞内可以起到渗透压调节的作用,于此同时,其他一些跟渗透压相关的代谢物在 S. stapfianus 中也都比在 S. pyramidalis 中高,包括三倍左右的阿拉伯糖醇(arabitol),赤藓糖醇(erythritol)和甘露醇(mannitol。另一个化合物甘油磷酸胆碱 (glycerophosphorylcholine)是一个在哺乳动物细胞内研究很多的渗透压调节代谢物,平时在植物里含量很低。但在 S. stapfianus 中,它的含量比在 S. pyramidalis 中高出11倍。
       对干旱敏感的 S. pyramidalis 在糖酵解和三羧酸循环代谢途径中的很多代谢物以及和淀粉合成相关的代谢物的浓度都比在抗旱的 S. stapfianus 里面要高。比如糖酵解途径的 果糖-6-磷酸(fructose-6-P)和 葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-P) 以及淀粉合成途径的蔗糖(Suc),麦芽四糖(maltotetraose)和麦芽五糖 (maltopentaose )的水平在 S. pyramidalis中比在 S. stapfianus高。三羧酸循环途径的代谢物柠檬酸(citrate),苹果酸(malate)和草酰乙酸(oxaloacetate 比在 S. stapfianus也都显著增高。这表明在基础代谢的状况下,不抗旱的 S. pyramidalis更注重于能量的代谢和生长。事实上也的确如此。比较在相同时间开始发育生长的 S. pyramidalis 和 S. stapfianus, S. pyramidalis 生长得更快,植株也更大。
       由以上信息综合推断,抗旱的 S. stapfianus 可能在平时就保持一个相对较低的基础代谢水平,这可能就是它对抗干旱的策略之一,即在干旱来临之时,保持较低的基础代谢水平可以受到较小的逆境冲击,并且能较快地调动抗逆的代谢途径来应对干旱。这种低水平的基础代谢加上叶片中较高浓度的氨基酸类代谢物、糖醇以及其他可用来调节细胞渗透压的代谢物质使得 S. stapfianus 在平时就有一个预先设置的干旱应对机制来准备对抗将要发生的失水胁迫。
       当干旱发生以后( RWC=60%),这时 S. stapfianus 已经有叶片卷曲,而S. stapfianus 则出现叶片卷曲和枯萎。分别比较S.  pyramidalis 和  S. stapfianus 的叶片代谢组相对于他们没有失水时的变化(图三),发现 S. pyramidalis 叶片中的代谢相对于未失水时变化较小,只有一些代谢物比如脯氨酸(Proline), 果糖(Fructose)和葡萄糖(Glucose)等的浓度增加(图三),显示 S. pyramidalis 试图进行了有限的渗透压的调节来防止水分的流失。糖类和脯氨酸在植物抗旱中对渗透压的调节作用以及脯氨酸去除羟基自由基的功能以前已有相关报道。与 S. pyramidalis 相反的是, S. stapfianus 在初期对干旱响应的阶段就发生了很剧烈的代谢调节,众多的氨基酸(包括脯氨酸),糖类(单糖,双糖,糖醇等)都显著增加,说明和 S. pyramidalis 相比, S. stapfianus对渗透压的调节更加广泛,防失水的能力也相应更强。氨基酸的迅速增加来源于 S. stapfianus 内在基础代谢条件下(未失水时)就已经储存的高浓度的天冬酰胺(Asn)

(图三)

(图四)
       在体内RWC<40%以后, S. stapfianus 主要依靠对氮代谢和氧化应激反应的调整来应对失水。其中氧化应激反应主要是通过增强谷胱甘肽 (glutathione,GSH) 的合成(图四)。谷胱甘肽的含量(氧化型)在干旱后期相比于干旱发生前增加约100倍。谷胱甘肽的前体甘氨酸(glycine)和半胱氨酸(cysteine)也都相应地增加了。另一类随着干旱显著升高的是 γ-谷氨酰氨基酸,包括γ-谷氨酰苯丙氨酸 (1873倍), γ-谷氨酰色氨酸 (955倍),和 γ-谷氨酰异亮氨酸 (21倍)和其他的一些γ-谷氨酰氨基酸。 γ-谷氨酰氨基酸参与的 γ-谷氨酰循环和谷胱甘肽循环有紧密的关系。另外两个化合物,邻苯二甲酸酯(ophthalmate) 和 2-氨基丁酸酯(2-aminobutyrate) 也随着干旱的加重增加。邻苯二甲酸酯 (glu-2-aminobutyrate-gly) 是一个谷胱甘肽的类似物。随着干旱在S. stapfianus 中积累的抗氧化剂除了谷胱甘肽还包括 α-生育酚 (2.8倍), β-生育酚 (35倍), 和 δ-生育酚 (89倍),多胺 putrescine (2倍) 和它的前体胍丁胺(4.7倍)。维生素C(ascorbate)的含量随着干旱的增加变化不大,说明它至少在 S. stapfianus 中和抗旱没有很大的关联。


总结


       本文运用两个遗传上非常相近但是抗旱表现截然不同的鼠尾粟属草本植物 S. stapfianus 和  S. pyramidalis 进行了比较代谢组学研究。在未失水条件下,抗旱的  S. stapfianus 拥有较低的能量代谢途径(糖酵解和三羧酸循环)代谢物,表明它保持着一个较低的基础代谢水平以应对将要发生的干旱,同时它的叶片内有较高浓度的游离氨基酸,糖醇和一些具有渗透压调节功能的代谢物,这使得  S. stapfianus 叶片细胞的渗透压调节会比较强,失水会比较慢。在干旱开始后, S. stapfianus 快速进行反应,产生更多的具备渗透压调节能力的代谢物和脂溶性的抗氧化剂来对抗失水和保护细胞膜的损伤。对干旱敏感的  S. pyramidalis 应对干旱的能力则差了很多,导致细胞功能因为干旱收到很大的损害。这说明  S. stapfianus 在长期的进化中形成了通过结合平时的代谢准备状态和在干旱来临时的快速应对来延缓叶片的失水和进行损伤的保护修复。随着干旱过程的逐渐发展,细胞失水越来越多,这时 S. stapfianus 开始启动一个复杂的多方面的代谢应对策略,包括迅速储存回收含氮的代谢物,以及开始强化氧化应激反应来应对细胞损伤造成的氧化压力(oxidative stress)。氧化应激反应的一个主要的表现是显著增加的 γ-谷氨酰氨基酸, 说明在  S. stapfianus 中,和动物相似,谷胱甘肽循环途径随着 oxidative stress 的严重而增强。随干旱增加的细胞内的游离 ammonia 的毒性则会通过含氮代谢物的增加来解除。另外邻苯二甲酸酯随着干旱的增加而积累是一个新发现,这在以前的植物抗干旱研究中没有被报道过。
       本文中的代谢组学实验使用的是美国 Metabolon 公司的非靶向代谢组学技术平台。